Tema 7. La investigación en inmunoterapia. Pongámonos la bata:
7.1. Introducción: Científicos, explosiones y anuncios de detergente.
El capítulo que tenemos por delante promete ser muy diferente a lo que estamos acostumbrados en este curso. Por primera vez, vamos a levantar la vista del sistema inmunitario y de las células cancerígenas y vamos a centrarnos en las herramientas que han ayudado a su comprensión: hoy vamos a hablar de lo que ocurre en los laboratorios.
Habitualmente, la imagen que se suele tener del científico está bastante sesgada por lo que vemos y leemos en todo tipo de medios, desde noticias a películas y anuncios.
Tenemos una versión tópica en la que, de manera sistemática, imaginamos un individuo de mediana edad, de sexo masculino y pelo alborotado que acostumbra a usar guantes, gafas y bata. Un ser despistado, rodeado de caos, desorden y líquidos de colores, pero, eso sí, que tiene una mente privilegiada, capaz de encontrar con rapidez una solución genial a los problemas más peliagudos, al grito de «¡Eureka!».
Desde que la publicidad se hizo dueña de la televisión, existe otra versión: recordemos los anuncios de detergentes, de pastas de dientes, o de productos estéticos; en ellos veremos a unos investigadores pulcros, de mirada seria, rodeados de aparatos futuristas, en cuyas pantallas holográficas flotan datos parpadeantes. Los científicos de estos anuncios funcionan como un sello de calidad: consultan dios sabe qué datos, dan su visto bueno al producto y nos recomiendan que lo compremos.
La verdad es que los científicos reales no se parecen en absoluto a los de estas representaciones. Por lo común son personas con vidas tan normales o tan extraordinarias como las de cualquier otra. Quizá cobren menos, pero son normales. El avance científico requiere mucha menos inspiración y genialidad que estudio y trabajo constante.
Es curioso pensar en las cosas que con frecuencia damos por hechas, ignorando el largo camino que se ha tenido que recorrer hasta conseguirlas. Esto, que parecería la frase típica de un coach aficionado al mindfulness, se hace muy patente en el caso de nuestra concepción de la naturaleza.
Afortunadamente, en el siglo XIX se produjeron enormes avances en la teoría y en la práctica de campos como la física y la química, gracias a los que se pudieron derribar dogmas equivocados que habían prevalecido durante milenios.
El avance de la ciencia está, pues, condicionado por la instrumentación y metodología de la que dispongan los científicos en cada momento de la historia. Por eso en este capítulo nos sumergiremos en algunas de las técnicas más utilizadas en la actualidad en el estudio del sistema inmunitario y el cáncer. Veremos cómo y cuándo surgieron, para qué sirven, y cómo se analizan sus resultados.
Así que enfundémonos la bata y entremos en el laboratorio imaginándonos que formamos parte de un proyecto de investigación en el que analizaremos el efecto de un novedoso tratamiento de inmunoterapia en pacientes con melanoma. Para comprobar los efectos de este tratamiento a diferentes niveles, para analizar los resultados y, finalmente, para comprobar nuestras hipótesis, deberemos realizar toda una serie de experimentos. Pongámonos a trabajar.
7.2. La microscopía y las técnicas histológicas
El ojo humano percibe cosas relativamente pequeñas, pero difícilmente puede detectar elementos con grosores menores al de un pelo humano, que ronda los 100 µm (0,1 mm). Sin embargo, la inmensa mayoría de células tienen un tamaño muy inferior, de hecho, de media las células humanas suelen rondar los 20 µm, y los linfocitos suelen ser mucho más pequeños. Para visualizar este tipo de elementos necesitamos utilizar la microscopía. Por su parte, la disciplina que estudia la estructura microscópica de los tejidos se denomina histología.
El siglo XIX marcó el inicio de la microscopía moderna. Los microscopios se refinaron considerablemente y se consiguió eliminar ciertas aberraciones visuales, lo que permitió observar que las células de los diferentes organismos, tanto animales como vegetales, tenían estructuras parecidas. Esto desembocó en la formulación de la teoría celular de Theodor Schwann en 1839: todos los tejidos y órganos están formados por células, de manera universal.
También entre el final del siglo XIX y principios del XX se realizaron avances que contribuyeron enormemente al estudio de los tejidos a través de los microscopios. En Europa la industria química estaba en pleno auge, en especial la aplicada a la generación de tintes textiles. Curiosamente, muchos de ellos resultaron tener una enorme utilidad para teñir de forma barata diferentes tipos y estructuras de las células y se siguen usando hoy en día.
Desde entonces la microscopía ha avanzado increíblemente: se pueden observar orgánulos celulares, células en movimiento, realizar reconstrucciones tridimensionales, visualizar interacciones de proteínas, trazar los recorridos de los linfocitos, etcétera.
Veámoslo con algo más de detalle.
7.2.1. Antes de usar el microscopio
Los microscopios utilizan diferentes fuentes de energía (como la luz o los electrones) para que incidan sobre la muestra y, con ayuda de lentes, podamos obtener imágenes magnificadas y con buena resolución. No vamos a entrar en la física ni la óptica de la microscopía, sino más bien en los métodos de trabajo y sus aplicaciones.
Un buen microscopio no es simplemente un instrumento que hace que veamos las cosas más grandes. Lograr esto, lo que llamamos magnificación, es relativamente sencillo. Lo complicado consiste en ver bien definidos esos elementos. Lo que convierte la microscopía en algo útil es la resolución.
Partamos de la base de que en nuestro proyecto de investigación hemos recopilado muestras de tumores de pacientes tratados con inmunoterapia o con otros tratamientos; queremos obtener información de la estructura microscópica del microambiente tumoral, tipos de células presentes, interacciones entre células… Lo primero que tenemos que hacer es preparar las muestras, algo en apariencia sencillo, pero que si no se hace de forma correcta puede tener consecuencias serias en la calidad de la imagen o incluso en la interpretación de los datos que obtenemos.
El primer paso consiste en fijar el tejido. Como decíamos antes, para detener los procesos de autodestrucción y putrefacción de las muestras biológicas, lo más común es sumergir la muestra (o una parte de ella, la que queramos analizar) en formalina, que consigue fijar los tejidos en unas 24 horas. Si los tejidos son gruesos la cosa se complica, porque la formalina puede no llegar bien a las partes más profundas y la muestra puede pudrirse por dentro. En ese caso para fijarlo hay que hacer virguerías tales como introducir la formalina por los vasos sanguíneos del tejido.
Tras garantizar su estabilidad, la transferimos a unos casetes, los soportes que sirven para contener la muestra en los pasos siguientes. El primero de ellos es retirar la formalina del tejido, después se deshidrata la muestra con alcohol y, finalmente, se elimina este antes de sumergirla en cera de parafina. Una vez fría, esta cera es un soporte magnífico para la conservación de tejidos, y, además, al ser rígida y no quebradiza, es ideal para laminar la muestra en secciones con un espesor tan pequeño que permita el paso de la luz a través de la misma, de manera que pueda ser estudiada al microscopio. (En un microscopio no podemos estudiar directamente la muestra embebida en cera, porque la luz no atraviesa algo de tanto grosor).
Precisamente, el corte de los tejidos en finas lonchas constituye una de las operaciones más complicadas en este proceso. Para conseguirlas se utilizan unos aparatos llamados microtomos, que permiten hacer secciones de grosores mínimos, inferiores incluso a 5 µm. Estos cortes se colocan en portaobjetos, láminas de cristal que mantienen estiradas estas rodajas y facilitan todo el trabajo posterior. Obtener un buen corte no es fácil, y requiere experiencia. Podemos encontrarnos infinidad de problemas técnicos: no conseguir un corte perpendicular a la muestra, cortar demasiado grueso o fino, que las secciones se deshagan o se agujereen, o que se enrollen cuando las ponemos en el portaobjetos… Eso sin contar los tajos que se puede llevar uno en el dedo si no manipula con extremo cuidado las cuchillas.
La fijación con formalina y el trabajo con parafina, no obstante, no siempre son los más adecuados. A pesar de que mantiene muy bien la morfología de los tejidos y garantiza la duración de la muestra, la formalina suele dañar las proteínas o alterar su estructura. Esto puede afectar a los experimentos que veremos más adelante. Por eso en ocasiones el tejido, en vez de conservarse en formalina y en parafina, se congela.
Llegados a este punto ya tenemos la muestra lista para observar al microscopio…, ¿o no? Si miramos cualquiera de estas secciones ahora mismo de manera directa bajo un microscopio, apenas veremos nada. Los tejidos recién cortados son tan finos que son prácticamente transparentes, y resulta casi imposible distinguir estructuras o unas células de otras. En función de lo que queramos ver, necesitamos teñir las secciones mediante diferentes procedimientos.
7.2.2. Visibilizando lo invisible
Lo primero que queremos observar de cualquier muestra es, a grandes rasgos, su estructura y composición. ¿El tejido es normal o patológico? ¿Se ven células tumorales? ¿Hay células del sistema inmunitario? ¿Dónde se encuentran?
En general se realiza una primera tinción con una combinación de tintes químicos denominados hematoxilina y eosina (H&E). El primero tiñe de morado los ácidos nucleicos y los ribosomas, mientras que el segundo tiñe de rosa las proteínas. Este tipo de tinción aporta una cantidad de información enorme, y es una amiga inseparable de cualquier patólogo que se precie: permite distinguir linfocitos de granulocitos y macrófagos, diferenciar las células tumorales de las normales, ver si un tumor es invasivo o no, qué estructuras está dañando, etc. Además, tiene otras ventajas, ya que es un método de tinción relativamente sencilla y se puede analizar con un microscopio de laboratorio estándar.
Existen muchas otras tinciones químicas que pueden destacar y dar color a otras estructuras, en función de lo que necesitemos analizar. Por ejemplo, el azul de toluidina permite ver claramente gránulos dentro de las células (como los de los granulocitos) o las mitocondrias, que no podemos ver mediante la H&E. La visualización de elementos celulares mediante sustancias químicas se denomina histoquímica.
Muchas veces necesitamos ser más finos y distinguir elementos celulares más concretos y específicos. Imaginemos que queremos detectar las células de los vasos sanguíneos porque queremos ver si los vasos tumorales son normales o están alterados. También podemos querer teñir un tipo concreto de células del sistema inmunitario, como los linfocitos T, para saber si están presentes en el tumor. Puede que queramos cuantificar las células tumorales que se están dividiendo. Para ello generalmente se utilizan anticuerpos.
En el capítulo 5 ya hablamos de los anticuerpos, unas moléculas biológicas que reconocen con altísima especificidad una molécula concreta y se unen a ella. También mencionamos que la biotecnología permite modificarlos para convertirlos en útiles herramientas de laboratorio. En el caso de las microscopía se pueden usar de diferentes maneras. Si estamos usando un microscopio estándar, de luz visible, podemos usar las técnicas de inmunohistoquímica. Veamos la siguiente ilustración:
Una de las limitaciones de este procedimiento es que la observación y visualización por métodos químicos requiere aquello que los elementos que teñimos se encuentren en grandes cantidades. En los linfocitos T la proteína CD3 es muy abundante, por lo que un marcaje por inmunohistoquímica distinguirá a estas células sin problemas. Lamentablemente, muchas otras proteínas son mucho menos abundantes, así que necesitaremos otro tipo de métodos y microscopios.
7.2.3. Microscopía de fluorescencia y confocal
Las medusas son seres sencillos, pero dan mucha guerra. Poca gente apostaría por que una medusa pudiera desatar una revolución en la biotecnología, pusiese patas arriba la investigación e incluso fuera la base de una serie de trabajos que se coronaron con un Nobel en 2008. Estamos hablando de la Aequoria victoria, una curiosa medusa que cuando se siente amenazada emite una suave luz verde.
En 1962 se descubrió que esta luz se producía gracias a un fluoróforo que llamaron Green Fluorescent Protein (GRP).
El GFP inauguró la era de las proteínas fluorescentes. Se desarrollaron métodos para mejorarlo y estabilizarlo, también para conseguir variaciones en el color que emitía (Yellow, Cyan, Blue Fluorescente Proteins, o YFP, CFP y BFP). Se encontraron otras proteínas fluorescentes en corales como el discosoma y se consiguieron derivados como la Red Fluorescent Protein (RFP) y muchas más. Hoy en día hay proteínas fluorescentes que cubren el espectro de colores visible, incluso hay algunas que emiten en colores que no vemos, pero podemos detectar.
Ahora bien, no siempre podemos introducir una proteína fluorescente en un organismo mediante la manipulación genética. En el caso de nuestro proyecto ficticio, queremos analizar muestras tumorales, extraídas de pacientes humanos tratados con inmunoterapia. En ellas queremos analizar si hay más linfocitos T que estén liberando interferón en la zona del tumor, es decir, que están más activos. Como las células humanas no emiten fluorescencia espontáneamente, la solución es, cómo no, utilizar anticuerpos.
De la misma manera que trabajábamos con muestras de inmunohistoquímica, podemos detectar la proteína que nos interesa con un anticuerpo contra interferón unido a una proteína fluorescente. No siempre encontraremos un anticuerpo comercial unido a una proteína fluorescente, por lo que podemos emplear, como antes, un anticuerpo contra interferón y luego un secundario unido, por ejemplo, a RFP. El uso de anticuerpos unidos a moléculas fluorescentes se denomina inmunofluorescencia.
Por lo general, para estar seguros de que lo que vemos bajo el microscopio refleja la realidad, se suelen teñir varios elementos celulares simultáneamente en cada análisis bajo el microscopio. Por ejemplo, para contextualizar nuestro interferón en la célula, podemos teñir los núcleos de las células con un tinte fluorescente que emita luz azul. También podemos teñir con anticuerpos el citoesqueleto de la célula, para ver por dónde andan las vesículas que contienen el interferón.
Escoger correctamente los fluoróforos es un auténtico arte, ya que las proteínas fluorescentes no emiten solo en una longitud de onda. Es decir, las proteínas como el GFP también emiten un poco en rojo, (y viceversa, muchas proteínas que emiten principalmente en rojo pueden tener emisión residual en verde). Por lo tanto, si no andamos con cuidado, podemos confundir lo que estamos viendo e interpretar incorrectamente los resultados.
Para analizar nuestra muestra marcada con proteínas fluorescentes necesitamos un microscopio de fluorescencia. Tiene varias particularidades que lo hacen diferente de un microscopio normal:
Gracias a la inmunofluorescencia podemos estudiar cuestiones como la presencia, localización, distribución y, de forma aproximada, la cantidad de la proteína que nos interesa, en este caso el interferón de los linfocitos T.
Pero podemos ser más finos aún. La microscopía de fluorescencia tiene una limitación que debemos tener en cuenta:
Mediante técnicas ópticas podemos excitar un solo punto de la muestra, y recoger exclusivamente la luz emitida por ese punto. Tal como vemos en el dibujo siguiente, podemos recoger todos los puntos que hay en un plano, y obtener una imagen de una sección de la imagen; como si cortáramos una loncha, vamos. Generalmente, por motivos de potencia, en lugar de lámparas normales se utilizan láseres, y en lugar de observar por un objetivo, lo visualizamos a través de un ordenador. Este método se denomina microscopía confocal y es esencial para comprender cómo están localizados los elementos celulares en el espacio. Estas técnicas permiten observar, por ejemplo, en qué punto exacto se une un linfocito T a una célula tumoral para destruirla.
Existe una aplicación muy útil de la microscopía confocal, en especial para comprender cómo se distribuyen e interaccionan entre sí las diferentes células en un tejido. Si analizamos diferentes secciones de un mismo tejido, podemos apilar digitalmente una encima de la otra y hacer una reconstrucción 3D del tejido. Si en nuestras muestras de tumores humanos queremos saber dónde se encuentran las células tumorales con respecto a los vasos sanguíneos y dónde se encuentran los linfocitos T, podemos hacer una reconstrucción 3D del tejido y obtener datos mucho más informativos de la posición de cada una de las células.
Cuando se explican las técnicas, suelen parecer fabulosas y casi mágicas. Sin embargo, seamos cautos. En especial, en el mundo de la microscopía de fluorescencia y confocal hay que ir con muchísimo cuidado a la hora de analizar cada muestra. La mayoría de fluoróforos emiten en más de un color, pueden interferir en lo que vemos y, si no damos con los ajustes adecuados en el microscopio, podemos llegar a conclusiones completamente erróneas: El procesamiento de la muestra, los productos que utilizamos o los anticuerpos que usemos para marcar pueden causarnos una gran variedad de artefactos (cuadro 1).
7.2.4. Microscopía electrónica y otras técnicas avanzadas
Hasta ahora, hemos comentado algunos de los métodos más habituales, especialmente a la hora de estudiar componentes del sistema inmunitario, pero el mundo de la microscopía es mucho más amplio y existen multitud de variantes.
La más obvia es la microscopía electrónica. En este caso, para visualizar la muestra no usamos luz, es decir fotones. Lo que se utiliza es una lluvia de electrones, que son dirigidos a la muestra gracias a campos electromagnéticos. Los electrones atravesarán la muestra en sus zonas menos densas, y serán absorbidos por los componentes más densos. De esta manera podemos observar, con altísima resolución, componentes celulares minúsculos, desde pequeñas vesículas a virus, invisibles de cualquier otro modo.
En otras ocasiones puede interesarnos observar cómo se comportan las células vivas dentro del propio organismo que queremos observar. Esto nos proporciona información de las células en su entorno natural, sin someterlas a procesamientos ni cortes. Hasta hace pocos años esto era prácticamente una utopía, sin embargo, hoy en día se está logrando gracias a toda una serie de técnicas de microscopía intravital o in vivo. No son de uso generalizado, pero pueden emplearse en un momento dado en que se requiera una información muy precisa del cerebro, el hígado, el corazón, etc., mediante la introducción de sondas endoscópicas. En zonas más accesibles, como la piel, se puede utilizar una variante de la microscopía confocal que tiene más poder de penetración y puede acceder a zonas más profundas, llamada microscopía de excitación de dos fotones. Este método permitiría seguir, por ejemplo, cómo se comportan los linfocitos a lo largo del tiempo en el melanoma de un ratón.
Recientemente se han hecho avances increíbles en la microscopía de fluorescencia. La resolución de los microscopios basados en lámparas o láseres tiene un límite físico insuperable: no se puede distinguir la separación de dos moléculas de fluoróforos que estén a menos de 200 nm. Ahora bien, gracias a una serie de algoritmos se puede predecir la localización de cada molécula de fluoróforo, y lograr resoluciones nunca vistas. Esto es lo que se llama microscopía de superresolución.
Muy bien. Gracias a los microscopios nos podemos hacer una idea de la estructura de las muestras que estamos analizando, de la composición de células, de sus interacciones…, pero estos instrumentos, a pesar de la calidad de sus imágenes, nos proporcionan información más cualitativa que cuantitativa. Si buscamos datos cuantitativos de las células presentes en un tejido, utilizaremos otras estrategias. Otro problema es que, hoy por hoy, todavía hay limitaciones a la hora de analizar con simultaneidad muchos tipos diferentes de células en un mismo experimento. Por ejemplo, puede interesarnos saber cuántos linfocitos T citotóxicos, cooperadores, reguladores y Natural Killers encontramos en una muestra. Es por esto por lo que necesitamos otro tipo de abordajes completamente diferentes. Nos sumergimos ahora en la técnica de inmunología por antonomasia, la citometría de flujo.
7.3. La citometría de flujo
Gran parte del conocimiento sobre el sistema inmunitario y la comprensión de su relación con el cáncer no se podrían explicar sin la citometría. De nuevo, nos hallamos ante una tecnología relativamente reciente, de apenas 50 años de antigüedad que, cuando se implantó, supuso un cambio radical a la hora de estudiar y cuantificar las células.
La clave de la citometría de flujo es que analiza una mezcla heterogénea de células de cualquier origen (desde sangre a un tumor, pasando por un ganglio linfático o cualquier otro tejido) extrae información de muchos parámetros simultáneamente de cada una de las células y permite compararlas entre sí y cuantificarlas.
Hasta bien entrado el siglo XX, cuando se necesitaba cuantificar las células que contenía una muestra, por ejemplo, de sangre de un paciente con leucemia, la única manera era a través de sistemas manuales que requerían contar las células bajo un microscopio. También era muy complicado separar y aislar diferentes tipos celulares de una muestra, por ejemplo, los distintos tipos de glóbulos blancos. Existían (y aún existen) complejos mecanismos de centrifugación que permitían separar algunos tipos celulares por su tamaño y densidad (algunos de los cuales se siguen usando), de modo tedioso y poco preciso.
La idea se afinó con rapidez, en gran parte gracias a la generalización del uso de los anticuerpos y la aparición de las moléculas fluorescentes que hemos comentado antes. Surgió la posibilidad de usar anticuerpos contra diferentes tipos celulares, que cada uno emitiese en una longitud de onda diferente, y así analizar las diferentes células de una muestra.
Hoy en día existe una inmensa disponibilidad de anticuerpos y marcadores fluorescentes para realizar distintos análisis con técnicas de citometría: detectar moléculas características de un tipo de células, cuantificar la muerte celular, contactos entre células, medir citocinas, observar fagocitosis y un sinfín de ensayos más.
Ahora bien, la citometría de flujo genera gran cantidad de información por cada una de las células que se analizan, y en cada tubo se suelen analizar millones. Por lo tanto, las progresivas mejoras informáticas han sido fundamentales para poder integrar, comprender y asimilar toda esta información.
El uso de la citometría se ha generalizado muchísimo, pero no todo el mundo tiene una idea clara de lo que pasa dentro de este ingenio tecnológico o lo sabe utilizar de manera óptima.
La mejor manera de comprenderlo es con la ayuda de nuestro proyecto ficticio. Recordemos que se trata de muestras de pacientes que han sido tratados con inmunoterapia y otros que no. Puede resultar interesante analizar la cantidad de linfocitos T citotóxicos (capítulos 1-3) que hay en cada una de las muestras con un tratamiento y con el otro.
7.3.1. Antes de pasar por el citómetro
El citómetro no es un instrumento mágico en el que introducimos directamente las muestras de sangre, órganos, tumores o tejidos y él las analiza. Es preciso realizar una serie de operaciones previas.
El primer paso es obtener una solución que contenga solo las células que queremos analizar. En el caso de una muestra sólida, como un tejido o un tumor, tendremos que quitar de en medio todo el tejido fibroso y estructural, vasos sanguíneos, etc., y quedarnos solo con las células. Esto se realiza por procesos de homogeneización, que suelen implicar una especie de batidoras en miniatura. Para colaborar en el proceso también se utilizan enzimas, como diferentes tipos de colagenasa, que digieren y disgregan los tejidos fibrosos y el colágeno que mantiene la estructura del tejido.
Es importante realizar de forma correcta la homogeneización o el citómetro se atascará. Esto retrasará nuestro experimento y provocará la justificada ira de los responsables del citómetro y de los compañeros que se hayan apuntado después de nosotros.
En el caso de las muestras de sangre, normalmente nos interesan todas las poblaciones celulares excepto los glóbulos rojos (o eritrocitos). Sin embargo, son muchísimo más numerosos que el resto de las células sanguíneas y su cantidad puede entorpecer el análisis. Por lo tanto, se eliminan mediante soluciones hipotónicas que los hacen estallar. Este paso es habitual no solo en muestras de sangre, sino, también, en muestras de tejidos sólidos con abundante sangre, como de hígado, bazo, determinados tumores, etcétera.
En el momento en que nuestras células flotan individualizadas en una solución, es cuando hay que marcarlas con anticuerpos unidos a fluoróforos (teñirlas). Para el ejemplo vamos a hacer una tinción muy sencilla, especialmente para comprender más adelante cómo se analizan los resultados de citometría. No obstante, según la complejidad del proyecto, el tipo de aparato y (en especial) la pericia del investigador, en ocasiones se pueden realizar análisis con el uso de alrededor de 20 anticuerpos.
En el cuadro 2, podréis encontrar algunos de los marcadores más comunes en citometría. Una vez hemos realizado la tinción, podemos ir finalmente al citómetro.
7.3.2. Cómo funciona un citómetro. Una explicación básica
Para explicarlo de manera muy resumida y simplificada, fijémonos en la siguiente ilustración.
Como veremos, algunos de los principios son muy parecidos a la microscopía confocal.
Antes de seguir, comentaremos ciertas consideraciones prácticas. Para empezar, conviene saber cuántas células contienen nuestras muestras. Si hay muchísimas, es mejor diluirlas un poco; si no, corremos el riesgo de que el instrumento no consiga analizarlas todas, que interprete la luz de dos células como la de una sola, o en el peor de los casos que se atasque.
En segundo lugar, un análisis de citómetro no es tan sencillo como meter las células en un aparato y sentarnos a esperar los resultados. Recordemos que estamos trabajando con fluoróforos que emiten luz en más de una longitud de onda. Eso significa que si tenemos más de un anticuerpo-fluoróforo en nuestra muestra, hemos de estar seguros de cuál de ellos emite la señal. Veámoslo con nuestro ejemplo:
La fluoresceína (FITC) emite principalmente en verde, pero también emite algo de luz amarilla, naranja y roja. La ficoeritrina (PE) emite principalmente en naranja, pero también un poquito en verde y en rojo. Si detectamos luz naranja en una célula, ¿cómo sabemos que proviene de un fluoróforo u otro? Este problema se vuelve exponencialmente más complicado cuantos más fluoróforos utilizamos (recordemos que se puede llegar a usar 20) Para poder discernir con seguridad y analizar los resultados con fiabilidad, hay que preparar una serie de controles, llevar a cabo calibraciones y efectuar unos ajustes de los parámetros de detección del aparato llamados compensación. Realizar una compensación correctamente es imprescindible, pero según la cantidad de anticuerpos que usemos, requiere la precisión de un orfebre. Una mala compensación puede dar resultados incomprensibles, incluso erróneos y mandar al traste un experimento de meses de duración.
7.3.3. Uniendo los puntos: el análisis de los datos de citometría
Por fin hemos pasado nuestras células por el citómetro y registrado los datos de cada una de ellas en un ordenador. Llega el momento de analizar los resultados. Todo el contenido de nuestra muestra está contenido en un archivo con la información generada por cada una de las células. Para leerlos necesitaremos softwares específicos.
En el ejemplo hemos realizado una tinción muy básica, para detectar linfocitos citotóxicos de nuestra muestra tumoral. Existen muchas maneras de analizar, pero vamos a usar una muy sencilla. En primer lugar, recordemos que cuando los láseres impactan en las células, parte de la luz se dispersa de manera particular y genera información. Sin entrar en muchos detalles, estos datos dan una idea del tamaño de cada célula (Forward Scatter, FSC) y de la complejidad y granularidad de su contenido (Side Scatter, SSC). Si lo representamos en un diagrama, lo que tenemos es esto:
Las células más grandes están a la derecha, las más complejas, hacia arriba. En la esquina inferior izquierda tenemos células muertas, rotas y porquería de la muestra. Como los linfocitos son bastante pequeños y no tienen mucha granularidad podemos identificarlos con facilidad. Este tipo de representación nos permite seleccionar las células que queremos analizar y representarlas en otro diagrama. Además, descartaremos células mucho más complejas y, sobre todo, células muertas que entorpezcan nuestro análisis. Esta selección aún es muy grosera, ni siquiera sabemos qué tipo de linfocitos estamos viendo. Para saber si hay linfocitos T, podemos representar en un histograma las células que hemos seleccionado y ver cuánta señal de verde emiten.
Gracias al fluoróforo FITC, una célula emitirá más luz verde, cuanto más anticuerpo contra CD3 tenga pegado. Por lo tanto, las células que caigan más a la derecha seguramente sean linfocitos T. Entre ellos habrá todo tipo de linfocitos T, citotóxicos, cooperadores, reguladores, etcétera.
Más aún, estamos intentando saber exclusivamente cuántos linfocitos T citotóxicos hay en esta muestra. Lo más efectivo es representar la señal que corresponde al CD3-FITC con respecto a la que emite CD8-PE:
Las células que están a la derecha emiten mucha luz verde, debido a que tienen unido mucho anticuerpo CD3-FITC y seguramente sean linfocitos T. Las células que están más arriba emiten mucha luz naranja, por lo tanto, tienen unido mucho anticuerpo contra CD8-PE. Fijaos que casi todas las células que tienen CD8 también emiten en verde. Esto es lógico: todos los linfocitos T-CD8 son linfocitos T, así que tienen CD3. Sin embargo, hay muchas células que tienen CD3 pero no poseen CD8. Estas serán otros tipos de linfocitos T, cooperadores o reguladores.
Además, los perfiles y el aspecto de los diagramas cambian muchísimo según el tejido que se tenga entre manos, así que antes de lanzarnos a experimentar con un tipo de tejido que no conocemos es fundamental haber realizado ensayos piloto para familiarizarnos con su análisis y para preparar una configuración específica del instrumento.
En la actualidad se están explorando nuevos caminos relacionados con la citometría. Para saber más, podéis acudir al cuadro 3.
7.4. La genómica
En la actualidad es difícil concebir un gran proyecto sobre inmunología o cáncer si no estudia de una manera u otra el genoma del paciente o de sus tumores. Hoy damos por hecho que el ADN contiene nuestra más íntima información genética y que gracias a él la transmitimos a las siguientes generaciones. Incluso en el mundo de los negocios se utilizan expresiones tan rimbombantes y estúpidas como “Esto está en el ADN de nuestra empresa”. No obstante, la concepción de la herencia a través de los ácidos nucleicos es muy reciente. Mucho. Lo cual resulta muy sorprendente, porque el interés por los mecanismos de la herencia es ancestral; al fin y al cabo, no hace falta ser un cráneo privilegiado para observar que hay elementos que se transmiten de los padres a los hijos, tanto en humanos como en animales.
La genética moderna nació a principios del siglo XX, cuando William Bateson redescubrió las publicaciones del monje agustino Gregor Mendel, y formuló las leyes de la herencia. En 1909, el botánico danés Wilhelm Johannsen acuñó la palabra “gen” para hablar de las unidades fundamentales que contenían información heredable. Lo curioso es que por aquel entonces no se tenía nada claro dónde se almacenaba esta información en las células, en qué lugar residían estos genes. La gran pregunta era: ¿la información genética está en las proteínas o en los ácidos nucleicos? En los años 30 las mejoras técnicas y la incorporación de la radiactividad para marcar las biomoléculas de la célula permitieron avanzar en la comprensión del funcionamiento celular y dar una respuesta a esta pregunta. En los 50 Hershey y Chase establecieron que los genes se encuentran en el ADN, y muy pronto Rosalind Franklin, James Watson y Francis Crick definieron el dogma central de la biología molecular: la estructura en doble hélice del ADN, cómo almacena la información de las células y cómo se hereda.
La genómica como tal, es decir, el estudio de toda la información genética de un organismo tuvo su advenimiento algo más tarde. Una cosa es conocer la estructura genérica del ADN y otra muy distinta, entender su secuencia. En 1977, Fred Sanger diseñó un método con el que consiguió secuenciar las 5.000 bases del genoma de un virus. No estaba mal, pero el genoma humano contiene alrededor de 3.000 millones, así que todavía quedaba un largo camino por recorrer. El problema era que los procesos de secuenciación eran muy costosos y laboriosos. Todo cambió cuando en 1985, Kary Mullis tuvo una epifanía en su coche y se le ocurrió un revolucionario procedimiento que le valió un Nobel. Lo veremos en profundidad en el próximo apartado.
Hablamos de la Polymerase Chain Reaction (PCR, reacción en cadena de la polimerasa). Esta técnica, y la posterior automatización de los sistemas de secuenciación permitieron a la comunidad científica de finales de los 80 plantear un proyecto internacional muy ambicioso, la secuenciación del genoma humano, una iniciativa monstruosa que culminó en 2003. Es difícil expresar en toda su magnitud la importancia de este evento. En primer lugar, proporciona una increíble cantidad de información evolutiva y de nuestros orígenes, tanto con respecto a otras especies como a las diferentes poblaciones humanas. La comprensión de las enfermedades y los mecanismos que llevan a ellas entra en otro nivel.
Con los años, la secuenciación ha avanzado enormemente, se ha vuelto más rápida, eficiente y barata, y su uso se ha generalizado en proyectos de investigación. Para que nos hagamos una idea, el proyecto Genoma Humano tuvo un coste de unos 2.700 millones de dólares, necesitó más de una década y la colaboración internacional de muchas organizaciones. Hoy en día se puede secuenciar un genoma en pocos días y por menos de 1.000 €.
En este bloque vamos a hablar de dos procedimientos fundamentales en el estudio actual de los genomas, la PCR y las diferentes formas de secuenciación masiva. Hay otras que también son importantes, pero como el espacio de este capítulo es limitado, tendremos que dejar fuera otras técnicas como los microarrays o formas más especializadas de la PCR, como la PCR cuantitativa.
7.4.1. Polymerase Chain Reaction, o cómo una técnica puede cambiarlo todo
La PCR lo es todo. De un modo u otro se acaba utilizando en la mayoría de los proyectos de investigación. Sus aplicaciones son de lo más variopinto. Es tan potente, sencilla y versátil que permite identificar y detectar secuencias que nos interesan, modificar genomas, detectar mutaciones, secuenciar, diagnosticar enfermedades (tanto de origen hereditario como infecciosas) e incluso constituye la base de numerosas pruebas forenses.
Pese a su uso generalizado, su comprensión puede resultar difícil y no todo el mundo que la utiliza acaba de tener claro su funcionamiento. Intentaremos explicarla a través del ejemplo de nuestro proyecto ficticio.
Para comprender la PCR hay que tener unos conocimientos básicos de la composición del ADN y la orientación de sus cadenas. Esto lo encontraréis en el cuadro 4.
El objetivo de esta técnica es amplificar (multiplicar) de manera exponencial un fragmento de ADN para poder detectarlo, medir o utilizar. En nuestro ejemplo partimos de muestras de tumores de pacientes tratados con inmunoterapia y otras que no. Es posible que sospechemos que los tumores que no responden tienen determinada mutación. En el siguiente experimento intentaremos ver qué muestras de tumor la tienen y cuáles no.
7.4.1.1. Preparándonos para la reacción en cadena de la polimerasa
Antes de empezar, obviamente, tenemos que obtener y purificar el ADN de nuestras muestras. Los sistemas de purificación de ADN de una muestra pueden ser muy diferentes, y dependen mucho del tipo de muestra del que partimos. Para ello existen métodos caseros y kits comerciales (muy caros, pero relativamente sencillos de utilizar), que permiten hacer extracciones desde cualquier tejido, desde sangre a tejidos sólidos, huesos, tejidos grasos, incluso desde muestras embebidas en parafina como las que se usan en microscopía. Casi todos los procedimientos tienen varios pasos en común: disgregar los tejidos, liberar el contenido de las células, eliminar la grasa y las proteínas y finalmente aislar el ADN. Es importante que estos pasos se realicen correctamente y la muestra esté lo más limpia de impurezas posible, para que no distorsionen los resultados.
Una vez tenemos el ADN purificado ya podemos empezar con el experimento. Prepararemos un tubo de reacción para cada una de las muestras que queremos analizar, y en cada uno de ellos introduciremos cierta cantidad de ADN acompañada de un cóctel de reactivos de los que el más importante es la polimerasa. Las polimerasas son una familia de proteínas que sintetizan ácidos nucleicos a partir de un molde. Una de sus funciones básicas es hacer una copia del ADN durante la división celular. En la PCR se usa una polimerasa especial, que soporta cambios de temperatura extremos, (incluso los 90 ºC), lo cual resulta muy útil, como veremos a continuación. El nombre de esta polimerasa especial es Taq Polimerasa, ya que se purificó de una bacteria denominada Thermus aquaticus, que sobrevive a temperaturas altísimas.
Otro elemento crucial son los llamados cebadores, aunque se usa mucho el anglicismo primer. Se trata de pequeñas secuencias de ADN, diseñadas para unirse a los extremos de la que queremos detectar y amplificar. Los cebadores son fundamentales, porque la polimerasa se sujeta a ellos y empieza a añadir nucleótidos y a copiar la cadena molde. En cada reacción se usan dos cebadores, uno para cada cadena de ADN.
Los primers tienen que unirse específicamente a la zona del ADN que nos interesa. No es sencillo establecer qué cebadores serán los mejores y cuáles funcionarán mejor, por lo que es fundamental conocer la secuencia que queremos amplificar. Se suelen usar herramientas informáticas, pero aun así a veces hay que probar con diferentes parejas de cebadores hasta que se da con la adecuada para cada reacción. Sin cebadores no hay PCR, así que merece la pena ser cuidadoso en este paso.
7.4.1.2. Lo que ocurre dentro de un termociclador
Una vez tenemos la mezcla de reacción y todos nuestros tubos, los introducimos en una máquina denominada termociclador y la reacción empieza. Veamos lo que pasa dentro de cada tubo.
La gracia es que en un solo ciclo hemos duplicado la cantidad de ADN con la secuencia que nos interesa. Si ahora repetimos los pasos del 1 al 3, los cebadores tienen el doble de secuencias molde a las que unirse, así que volveremos a duplicar la cantidad de ADN con la secuencia de interés. Si lo realizamos durante 30 ciclos, que es para lo que solemos programar el termociclador, de una sola secuencia de ADN obtendremos más de cien millones de copias en unas cuatro horas de experimento. Si la muestra no contenía la secuencia que reconocen los cebadores (en nuestro caso si los tumores no tenían cierta mutación), no se amplifica nada.
No hemos acabado aún. Ahora es el momento de visibilizar el resultado de la PCR.
7.4.1.3. Bandas y más bandas
Uno de los métodos más sencillos y usados consiste en lo siguiente:
En nuestro caso, solo veremos una banda de ADN en las muestras de tumor que contengan la mutación que buscamos.
Eso sí. Existe toda una colección de problemas asociados a esta técnica. Por ejemplo, si no hemos escogido bien los cebadores, puede ocurrir que no tengamos amplificación, o que se unan a más de un sitio y amplifiquen fragmentos de ADN que no deseamos (en cuyo caso veremos bandas en el gel que no se corresponderán con la mutación). Puede ocurrir también que no escojamos bien las temperaturas de alineamiento, lo que provoca que los cebadores no se unan donde deben, o que no se unan en absoluto a la hebra molde. Si la muestra no es pura o se nos ha contaminado con ADN de otras muestras (incluso el nuestro propio), los resultados pueden ser erróneos. Si no hemos purificado bien el ADN, lo más probable es que la reacción de PCR ni siquiera tenga lugar. Resumiendo, los problemas en esta técnica son habituales, así que es conveniente realizarla con mucho cuidado y precisión.
Lo interesante de esta técnica es que es la base de infinidad de procedimientos más complejos. Si queremos introducir un gen de un organismo en otro, podemos amplificar el gen original mediante PCR para obtener una cantidad suficiente que nos permita empezar los procedimientos de ingeniería genética. Existen refinamientos de la PCR mediante la utilización de sondas fluorescentes que permiten calcular con exactitud qué cantidad de un fragmento de ADN (o de ARN) hay en una muestra (en lo que se denomina PCR cuantitativa). Pero como decíamos antes, la secuenciación eficiente de los genomas de los organismos no se entiende sin este procedimiento.
7.4.2. La secuenciación masiva, llevando la reacción en cadena de la polimerasa a cotas inimaginables
La secuenciación masiva, o la secuenciación de la siguiente generación (Next Generation Sequencing o NGS), es como se denominan todos aquellos procedimientos que permiten secuenciar a gran escala cualquier tipo de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN.
La secuenciación tradicional, la que diseñó Sanger (ver arriba) y se refinó poco más tarde, tiene sus limitaciones. La primera, es que es un proceso muy costoso en términos de tiempo y dinero, además de extremadamente tedioso. La segunda, es que solo se obtiene información de una cadena de ADN. La razón de que esto sea una limitación la tenemos en nuestro ejemplo, en el que partimos de muestras de un tumor, que contienen tanto células tumorales como células sanas. Probablemente incluso tengamos varias células tumorales con mutaciones diferentes (capítulo 3). Si solo obtenemos la información genética de alguna de estas células, estamos ignorando a todas las demás y no estamos obteniendo resultados que verdaderamente representen la muestra. La capacidad de secuenciar una zona del genoma correspondiente a células diferentes en una misma muestra se denomina profundidad.
Las nuevas técnicas superan con amplitud estas limitaciones. Por un lado, han reducido increíblemente los costes de secuenciación, incluso cuando hablamos de organismos completos. Por otro lado, con ella somos capaces de obtener información de los genomas de muchas células diferentes presentes en una muestra, también podemos detectar ciertas alteraciones en el ADN que con la secuenciación de Sanger tendríamos problemas en identificar (cuando un fragmento de los cromosomas está duplicado o está ausente).
La NGS nos abre, pues, un mundo de posibilidades que hasta el momento estaban fuera de nuestro alcance. Con ella podemos identificar mutaciones o alteraciones que causan enfermedades que en la actualidad no tienen una explicación, y podemos identificar poblaciones de células tumorales no mayoritarias en un tumor pero que sean relevantes. Existen incluso técnicas (todavía por refinar) para aislar y secuenciar el ADN de una sola célula (single cell sequencing). Al final, un uso fundamental de la NGS es el estudio sistemático de los tumores de los pacientes, en busca de un mejor diagnóstico y opciones terapéuticas individualizadas y personalizadas.
7.4.2.1. Cómo funciona la secuenciación masiva
En realidad, no hay un protocolo único para realizar este tipo de secuenciación. Hay varias plataformas e instrumentos, aun así, todos tienen algo en común. Todas secuencian millones de fragmentos de ADN de manera simultánea y luego se hace una reconstrucción bioinformática para ensamblar digitalmente los genomas de la muestra. Se puede secuenciar el genoma entero, zonas concretas de interés, exclusivamente los genes (ignorando la inmensa mayoría del ADN, que no codifica para proteínas), o un grupo concreto de genes que queramos estudiar.
Técnicamente el proceso es complejo, Así que lo veremos en términos generales para tener una idea de cuál es el material de partida, qué es lo que está pasando en un secuenciador, y qué resultados se obtienen.
En nuestro caso partiríamos del ADN ya purificado de las muestras de tumores de nuestro proyecto imaginario. Queremos comparar los tumores que han respondido bien al tratamiento con los que no lo han hecho. A través de un estudio de NGS es posible que detectemos mutaciones que aparezcan solo en el grupo que no responde, y que puedan ser estudiadas más tarde en profundidad. Insistimos: en la muestra habrá ADN de células tumorales con mutaciones diferentes y ADN de células normales.
El primer paso común de todos los protocolos de secuenciación consiste en transformar y adaptar el ADN de la muestra a un formato que sea compatible con la plataforma de secuenciación que se vaya a utilizar:
A partir de aquí, el proceso difiere en cada una de las plataformas de secuenciación. En algunos casos, todos los fragmentos de ADN que forman las librerías se unen a pequeñas esferas. En otros (como en la plataforma Ilumina, el que vemos en la ilustración), estos fragmentos se unen a un soporte plano rígido. En ambos casos el objetivo es utilizar métodos especializados de PCR para multiplicar muchas veces cada uno de los fragmentos. La gracia es que, en lugar de flotar libremente, todas las copias están fijadas a un soporte que físicamente está muy cerca de la original. Al final, después de todo un conjunto de pasos adicionales, añadiremos una serie de reactivos de secuenciación e introduciremos nuestras muestras en el secuenciador.
Ojo, esto no es un proceso mágico en el que de pronto tenemos una secuencia con las mutaciones que estábamos buscando perfectamente identificadas, marcadas y descritas. Estas técnicas de alto rendimiento generan tantos datos que pueden abrumarnos o incluso inducirnos a errores. Se requiere mucha experiencia y dominio de la bioinformática para comprender e interpretar la ingente cantidad de información que obtenemos de cada una de las muestras, además de tener muy clara cuál es la pregunta que nos hacemos en nuestro experimento.
Por el momento hemos realizado estudios en los que simplemente hemos descrito, en diferentes grados de profundidad, nuestras muestras: Su estructura, composición, genoma, etc. Con base en la información que hemos ido recopilando, llega el momento de poner en marcha experimentos para validar las conclusiones y las hipótesis a las que hayamos llegado. Con este fin vamos a utilizar modelos, que son sistemas de trabajo que reproducen hasta cierto punto las características de un ser humano. Trabajando sobre estos modelos alteraremos diferentes mecanismos celulares, simularemos situaciones patológicas y haremos pruebas de concepto. Es por esto que este tipo de experimentación se denomina ensayos funcionales.
7.5. Los ensayos funcionales
Antes de empezar, hagamos una reflexión previa. La utilización de sistemas celulares, y mucho más los animales, requieren unas instalaciones muy específicas y son muy costosos en reactivos y materiales. Así pues, conviene tener muy claras qué preguntas queremos responder antes de ponernos a experimentar con cualquiera de estos modelos, y contar con una buena base de bibliografía o de resultados preliminares. Por otra parte, tanto para trabajar con cultivos celulares como con animales es necesaria una formación adecuada sin la cual no podemos manipular ninguno de estos modelos.
Generalmente no se realiza experimentación sobre animales sin antes haber obtenido evidencias en cultivos de células, por lo tanto, empezaremos por ahí.
7.5.1. Los cultivos celulares
Durante los últimos cien años, una de las obsesiones de la ciencia biomédica ha sido obtener plataformas que permitan la experimentación y la observación, que sean baratas, manipulables y que posibiliten la obtención de resultados reproducibles por otros investigadores. Tras décadas de investigación se han ido desarrollando sistemas para cultivar todo tipo de células, tejidos e incluso órganos.
En los primeros intentos se trató de mantener vivos fragmentos de órganos, tejidos o sangre, mediante soluciones salinas que reproducían, hasta cierto punto, las condiciones del interior del organismo. Pero las células necesitan mucho más que sales: precisan azúcares, grasas, aminoácidos y toda una serie de factores de crecimiento (capítulo 3). A principios del siglo XX Alexis Carrel mejoró los medios de cultivo, a los que empezó a añadir suero de ganado, con gran parte de los nutrientes y factores que requiere una célula para vivir. Más importante aún, puso de relieve la necesidad de trabajar en esterilidad para evitar la contaminación de los cultivos. Esto era especialmente importante en aquella época, en la que aún no se añadían antibióticos o fungicidas a los medios de cultivo. Por desgracia, solo se conseguía mantener un tiempo la vida en tejidos heterogéneos o fragmentos de órganos. Todos los intentos para mantener vivas las células de un tumor, por ejemplo, fracasaban.
No fue hasta 1951, que se logró aislar y cultivar de manera indefinida células tumorales del cérvix de una mujer llamada Henrietta Lacks. Las dos primeras letras de su nombre y apellido dieron nombre a la primera línea celular, las células HeLa. Tenían la característica de que crecían como una capa de una célula de grosor, se multiplicaban con rapidez y, a diferencia de las células sanas, lo hacían de manera indefinida sin envejecer y volverse senescentes. A partir de aquí se empezaron a utilizar técnicas parecidas de aislamiento para desarrollar nuevas líneas celulares de diferentes organismos.
A continuación, estudiaremos los diferentes aspectos que hay que tener en cuenta para trabajar con células y pondremos algunos ejemplos.
7.5.1.1. El cuarto de cultivos no es tu cocina
Antes de ponernos a trabajar con células, como siempre, unas consideraciones: en primer lugar, las contaminaciones en los cultivos son sumamente fáciles si no vamos con cuidado. Al fin y al cabo, nuestras células van a vivir en unas placas o ampollas llenas de medios sumamente nutritivos, muy apetitosos para hongos y bacterias. Por otra parte, muchas veces utilizamos reactivos y químicos que pueden ser dañinos para el usuario y otros compañeros. Finalmente, mantener las células vivas es más complejo que echar nutrientes a las células. No olvidemos que estamos intentando reproducir las condiciones de un organismo.
Normalmente, este tipo de trabajo se realiza en instalaciones destinadas exclusivamente a eso y es importante que sea así; sería peligroso, por ejemplo, estar trabajando con líneas celulares en el mismo cuarto en el que se están desarrollando experimentos con bacterias o levaduras que podrían contaminar nuestros experimentos. Por razones similares todos los materiales que se utilizan deben estar esterilizados y limpios, y deben desecharse después de utilizarse. Otra medida de seguridad es que este tipo de laboratorios han de tener una presión positiva, para que no entre aire potencialmente contaminado desde el exterior.
Un elemento clave de estos laboratorios son las cabinas de cultivo, un pequeño recinto con una apertura que facilita el trabajo con las células sin contaminarlas, a la vez que el usuario permanece protegido. Constan de un ingenioso sistema de flujo de aire y filtros que evitan que caigan partículas o microorganismos de nuestras manos sobre los medios de cultivo. Ahora bien, una cabina de cultivo no es una garantía total de esterilidad: hay que mantenerlas impecables, limpiar lo que manchamos después de cada uso y evitar saturarlas de trastos que alteren el flujo del aire. La mancha de un medio de cultivo sin limpiar puede ser un foco para que crezcan alegremente todo tipo de microorganismos que luego contaminarán nuestros experimentos. No hay nada que dé más rabia que perder un experimento de varios meses por una contaminación.
Algo que suele olvidar mucha gente es que no solo importa el trabajo que tú estás realizando. Siendo limpio no solo evitas que se contamine tu experimento, sino el de otros compañeros. La dejadez de un solo investigador puede arruinar el trabajo de todo un departamento (no estoy exagerando).
7.5.1.2. Los diferentes tipos de cultivos celulares
Gracias a las técnicas modernas, se puede conseguir mantener en crecimiento una enorme variedad de tejidos y de tipos celulares. Según su origen, sin embargo, cada tipo de cultivo tiene sus pequeñas particularidades.
Empezaremos hablando de los cultivos primarios, directamente obtenidos de un tejido sano o tumoral. Como partimos de estructuras complejas, que podrían interferir en el crecimiento celular, por lo general se somete a los tejidos o trozos de órganos a intensos tratamientos con enzimas, para liberar a las células de toda la matriz que las rodea y separarlas unas de otras. Esto no es sencillo. Según cuál sea su tipo de tejido, estos cultivos pueden ser extremadamente complicados. Muchas veces las células no llegan a multiplicarse, o dejan de hacerlo a los pocos días, incluso cuando se trata de tumores. Otro problema es que, como las células sanas solo se dividen un número de veces antes de volverse senescentes, dejan de multiplicarse y se vuelven inactivas, por lo que, muchas veces, estos cultivos tienen una vida limitada.
Por otro lado, cuando se consigue que los descendientes de un tipo de célula se propaguen y multipliquen de manera más o menos indefinida, podemos establecer una línea celular, un cultivo continuo. Muchas veces estas líneas derivan de células tumorales, pero en ocasiones pueden manipularse genéticamente células sanas para que se dividan sin entrar en senescencia. Ahora bien, cada vez que dejamos que una línea celular se divida, en especial si son de origen tumoral, se pueden acumular mutaciones. Esto quiere decir que, si no vamos con cuidado, los experimentos que hicimos hace un año puede que no se reproduzcan con nuestros cultivos actuales. Conviene mantener una buena cantidad de células congeladas que acumulen pocos ciclos de división, para garantizar que nuestros estudios son reproducibles.
Aunque los cultivos adherentes son prácticos y útiles, en ocasiones necesitamos reproducir de forma más fiel lo que ocurre en un tejido. Al fin y al cabo, las células tienen un contexto tridimensional, no crecen solamente en 2D. Por tanto, algunos tipos de experimento pueden aproximarse más a la realidad si se realizan en cultivos 3D. Estos se llevan a cabo en pequeños biorreactores o utilizando geles en vez de medio de cultivo. No obstante, en muchas ocasiones tenemos suficiente para nuestros estudios con realizar cultivos en 2D, mucho más sencillos y baratos.
7.5.1.3. Experimentando sobre líneas celulares
Ahora que ya sabemos cómo cultivar nuestras propias células, es la hora de realizar su análisis, y para ello pondremos un ejemplo típico de ensayo funcional. Volvamos a nuestro hipotético proyecto: los anteriores análisis, especialmente los datos de genómica sugieren que los melanomas que no responden al tratamiento que estamos estudiando presentan ciertas diferencias con los que sí responden. Los datos muestran que existe un gen que está mutado en un alto porcentaje de los pacientes que resisten a esta inmunoterapia. Este gen da lugar a cierta proteína (que llamaremos proteína X) que regula el ciclo celular (capítulo 3). Atacar farmacológicamente a esta proteína X podría ser una alternativa útil a la hora de combatir el cáncer de las pacientes que no responden a nuestro tratamiento inmunológico. Por cosas del azar, tenemos acceso a varios fármacos y compuestos dirigidos contra la proteína X, que denominaremos compuestos A, B y C. Para comprobar si alguno de estos fármacos puede resultar útil, realizaremos un experimento funcional sobre células de melanoma.
En la práctica no siempre es sencillo obtener las células que necesitamos. Cada laboratorio suele tener una colección de líneas, pero no se ajustan a nuestras necesidades en todas las ocasiones. Una alternativa puede ser solicitarlas a otros laboratorios, mediante acuerdos de cesión de materiales. Recordemos que siempre que obtengamos células de otro laboratorio, aunque sea de confianza, deberemos realizar una validación que certifique que son lo que tienen que ser. En otras ocasiones podemos obtenerlas comercialmente, aunque hay que tener en cuenta que los precios pueden ser elevados. Muchas veces, sin embargo, deberemos buscarnos la vida con lo que tenemos, al no encontrar las células ideales.
Daremos por hecho que tenemos suerte y contamos con tres líneas de melanoma que tienen alterada la proteína X, tres que no y una línea de células sanas.
Es el momento planificar muy bien nuestro experimento.
Una vez planificado el experimento tendremos que obtener suficientes células de cada tipo para poder llevarlo a cabo. Generalmente esto no es un problema, pero algunas líneas celulares, a pesar de ser tumorales, crecen muy lentamente, y esto significa que tendremos que ser muy previsores y planificar bien nuestros experimentos para poder tener el número de células necesario.
Cuando tenemos una cantidad suficiente, introduciremos el mismo número de células en cada pocillo. Esto debe hacerse con gran precisión para que los resultados sean comparables. Si estamos tratando con células tumorales adherentes (ver arriba) deberemos dejar transcurrir entre 6 y 24 horas para que se sujeten a la superficie del plástico. Una vez estén adheridas, añadiremos con gran cuidado y precisión las dosis exactas de los compuestos A, B y C. Cuanto más cuidadosos seamos, menor variabilidad obtendremos en nuestros resultados.
Por lo general el resultado de este tipo de experimentos suele observarse a las 48-72 horas, que es tiempo suficiente para que los fármacos hayan actuado. La manera de saber si son efectivos o no, es ver cuántas células han muerto y cuántas siguen vivas en cada uno de los pocillos. Para cuantificar esto existen varios sistemas de colorantes, químicos o reactivos fluorescentes que marcan las células que permanecen vivas. Cuanta más señal obtengamos en un pocillo, significa que hay más células vivas. Nuestra referencia siempre serán los pocillos de las células sin tratar. Si obtenemos menos señal en las células tratadas, significa que el fármaco está matándolas y, por tanto, haciendo efecto.
Por lo tanto, el compuesto B elimina exclusivamente a las células que albergan mutaciones en X, y no afecta a las células sanas. Con estos resultados podemos plantearnos seguir estudiándolo en modelos más complejos. Nos disponemos, pues, a investigar en los experimentos con modelos animales.
7.5.2. La experimentación en animales
Llegamos a la que quizá sea la práctica de laboratorio socialmente menos popular, la utilización de modelos animales de laboratorio. Es natural. En muchos experimentos, en especial en los que tienen que ver con el cáncer, es inevitable provocar cierto grado de estrés y en ocasiones dolor a otros seres vivos. Sin embargo, las pruebas de concepto en otros organismos han sido fundamentales para la medicina. De los más de 100 premios Nobel de fisiología y medicina desde 1901, en 83 casos los trabajos galardonados han involucrado la experimentación con vertebrados no humanos. De hecho, es impensable concebir el descubrimiento y desarrollo de las vitaminas, los antibióticos, las transfusiones, la inmunología en general o cualquier tratamiento contra el cáncer, sin el uso de modelos animales.
Aun así, los científicos estamos muy lejos de la imagen que se muestra en ocasiones de individuos desequilibrados que infligen dolor de manera gratuita y cruel a otros seres vivos. Para garantizar la investigación responsable y respetuosa con los organismos de laboratorio, las leyes que la regulan se han ido endureciendo de forma progresiva: el número de animales que se utiliza se regula muy rigurosamente, se deben justificar muy bien los procedimientos que se van a llevar a cabo, y en las ocasiones que sea posible, se debe utilizar otro tipo de modelo. Es lo que popularmente se denomina «las 3 erres«:
El trabajo con animales no se puede improvisar. Lo debe realizar personal acreditado, es obligatorio recibir diversos tipos de cursos y formación. Además, para cualquier tipo de procedimiento se deben solicitar permisos aprobados por los comités de ética del centro donde se desarrolla la actividad y las autoridades autonómicas correspondientes. Lograr los permisos para experimentar con un número limitado de animales puede llevar meses de papeleo, así que es importante realizar una planificación con bastante antelación.
7.5.2.1. Por qué usamos ratones
Si buscamos un buen organismo modelo, sobre el que realizar experimentos de cáncer, debemos tener varias cosas en la cabeza. En primer lugar, tiene que ser lo más parecido posible a los seres humanos. Esto es fundamental si queremos obtener resultados extrapolables y que sienten las bases de posibles terapias. Debe ser fácil y barato de mantener en unas instalaciones, para no disparar los costes de las investigaciones. Y algo fundamental, es importante que se reproduzca con rapidez, para poder contar siempre con un número suficiente.
Según este razonamiento, los ratones son una especie ideal para la experimentación:
Otro punto a favor muy particular de los ratones es la gran variedad de cepas que existen. Las cepas son variedades, poblaciones con unas determinadas características. Esta abundancia de variedades proviene de la ancestral afición del ser humano por coleccionar cosas. A lo largo de la historia, incluso en civilizaciones antiguas, había personas que criaban y comercializaban ratoncitos con pelajes o características curiosas. Esto no hubiera pasado de una curiosidad si a principios del siglo xx no hubiese estallado el interés por la genética. Los investigadores estaban ansiosos por dejar a un lado los guisantes y encontrar modelos animales sobre los que probar las leyes de la herencia de Mendel. En este contexto, los aficionados a los ratones, como Miss Abbie Lathrop, cobraron una importancia fundamental al proporcionar una gran variedad de ratones con rasgos diferentes. Los científicos los cruzaban y estudiaban cómo se heredaban las diferentes características, como el pelaje, forma de las orejas, tamaño, etc.
Para establecer colonias de ratones más homogéneas, se empezó a cruzar los hermanos de pelajes parecidos que nacían en cada camada. La repetición de esta práctica iba dando lugar a camadas genéticamente cada vez más parecidas, hasta dar lugar a lo que hoy llamamos líneas de ratones consanguíneas (o inbred). Estos animales son la base de gran parte de la experimentación actual, por varias razones:
• Son virtualmente idénticos genéticamente.
• La variabilidad entre los individuos es baja: factores como el tamaño, peso, susceptibilidades o resistencias a determinadas enfermedades (cáncer entre ellas) se mantienen en rangos limitados.
• Son, por tanto, una herramienta de laboratorio fantástica, porque al ser todos los animales parecidos, los experimentos son comparables entre sí y los resultados tienen más solidez. Podemos evaluar, por ejemplo, la toxicidad de un compuesto en un grupo de ratones sabiendo que todos van a reaccionar de manera parecida. Los resultados serán más sólidos y estadísticamente relevantes. Además, al haber menos variabilidad de los resultados, se puede reducir el número de ratones por experimento.
Pronto las diferentes cepas de ratón empezaron a clasificarse y a conservarse de manera más sistemática, hasta el punto de que hoy en día casas comerciales como The Jackson Laboratories o Charles River Laboratories cuentan con cientos de tipos diferentes que se ajustan a toda suerte de experimentos.
Con el advenimiento de la ingeniería genética se abrió además otra puerta, la de eliminar, introducir, reemplazar, alterar o modular genes. Los animales genéticamente modificados nos facilitan el estudio de genes concretos y facilitan un estudio mucho más específico y profundo del funcionamiento de los organismos. Algunas de estas estrategias las vemos en la ilustración:
En la actualidad existen estrategias de modificación genética muy complejas y refinadas. Es posible obtener ratones que sean perfectamente normales (o wild-type), pero que, en algún momento de su desarrollo, pierdan un solo gen en algún tejido específico de su organismo, o incluso, perderlo cuando nosotros decidamos. Al no darse en todo en el organismo, sino en contextos concretos, estas modificaciones se denominan condicionales.
7.5.2.2. Mil y una maneras de estudiar el cáncer en modelos animales
Veamos ahora cómo nos pueden ayudar los ratones en el estudio del cáncer. Pero seamos realistas. Pese a las similitudes que compartimos con ellos, existen diferencias significativas que en ocasiones impiden extrapolar los resultados a los seres humanos.
Desde los inicios de la investigación del cáncer en animales, se han desarrollado varias estrategias experimentales, cada una con sus ventajas y sus inconvenientes. Aunque algunas de ellas son muy espectaculares, es importante saber cuál se ajusta más al tipo de experimento que queremos llevar a cabo o acabaremos obteniendo resultados poco relevantes, gastando dinero a espuertas y provocando sufrimiento innecesario a muchos seres vivos.
Para estudiar el cáncer necesitaremos ratones que desarrollen tumores. Ciertas cepas de ratón implementan con espontaneidad determinados tumores a lo largo de su vida. Algunas tienen alta susceptibilidad a padecer linfomas, cáncer de hígado, cáncer cerebral, etc. Los estudios sobre estos animales son interesantes, porque son tumores desarrollados de manera fisiológica por el animal, que pasan por todos sus estadios y tienen un microambiente complejo, parecido al de un tumor humano.
El problema de planear experimentos con este tipo de animales es que no siempre desarrollan los tumores a la vez, y es difícil predecir cuándo va a ocurrir. Esto complica muchísimo el diseño y la planificación de los experimentos. Ahora bien, existen modelos genéticamente modificados que producen ciertos tipos específicos de tumor en un periodo más acotado de su vida. Por ejemplo, las cepas a las que se les introduce la modificación MMTV-PyMT desarrollan tumores de mama a las pocas semanas de su nacimiento, en un periodo bastante preciso. Aun así, trabajar con estos modelos es laborioso, ya que requiere monitorizar la colonia de manera constante para organizar los experimentos tan pronto como aparezcan los tumores o alcancen un determinado tamaño. Por otro lado, se trata de colonias complicadas de manejar, porque muchos de estos animales mueren jóvenes debido a sus tumores. Es fundamental permanecer atento y tener siempre animales jóvenes apareándose, o podemos quedarnos sin animales reproductores y perder la colonia.
La alternativa a la estrategia anterior son los tumores trasplantados. La idea es sencilla: se parte de animales genéticamente idénticos, se les introduce un tumor cuando nosotros deseamos, y luego realizamos nuestros experimentos. Esto simplifica mucho los problemas que tienen los modelos de tumores espontáneos, ya que sabemos con exactitud cuándo se inicia el tumor y simplifica muchísimo la organización del experimento.
Cuidado: cuando hacemos un xenograft, ya sea de líneas celulares como de tumores implantados, nos enfrentamos a un problema importante. Recordemos que el sistema inmunitario está diseñado para rechazar cualquier elemento ajeno al organismo (capítulo 1). Por lo general, siempre que introduzcamos un tejido humano en un ratón, será rechazado y eliminado con rapidez. Esta es la razón por la cual en muchos experimentos de cáncer se utiliza alguna de las múltiples cepas de ratones inmunodeficientes.
Las colonias de estos ratones son increíblemente complejas de gestionar, por lo que normalmente cuando necesitamos ratones de este tipo solemos recurrir a casas comerciales. Eso sí, cada ratón puede costar entre 70-100 €, así que conviene planificar muy bien los experimentos si no queremos arruinarnos. Además, al ser inmunodeficientes deben estar ubicados en zonas libres de patógenos de los animalarios, que requieren unas instalaciones especializadas.
Otra vuelta de tuerca: estos modelos inmunodeficientes son fantásticos para estudiar tumores y la acción de determinados fármacos o compuestos. Pero ¿qué hay de la inmunoterapia? Recordemos que muchos de estos tratamientos se basan en reactivar a los linfocitos T. Obviamente no podemos reactivar a estas células en unos ratones que carecen de ellas. Para salvar este nuevo obstáculo se están empezando a utilizar ratones cuyo sistema inmunitario ha sido reemplazado por uno humano, son lo que se denomina ratones humanizados. Esto permite tener ratones con un sistema inmunitario funcional, que no rechacen los tumores humanos cuando los implantemos, y que respondan a inmunoterapia. Eso sí, el uso de estos modelos no está aún generalizado, por su complejidad y su altísimo coste económico.
7.5.2.3. Bajando al animalario
Es la hora de preparar nuestro propio experimento. Continuando con los resultados que habíamos obtenido en líneas celulares, nuestro objetivo es comprobar si el compuesto B es útil para tratar tumores que presenten mutaciones en la proteína X. Para ello haremos, por ejemplo, un experimento de xenograft con tumores humanos que tengan o no esa mutación, y los trataremos con el compuesto B. Como hablamos de tejidos de origen humano, utilizaremos ratones inmunodeficientes, en este caso ratones desnudos.
Antes del experimento, deberemos obtener esos tumores para poder implantarlos en los ratones. Puede ocurrir que nuestro laboratorio tenga su propia colección de tumores, que conozcamos laboratorios que nos los puedan proporcionar, o que tengamos que recurrir a un biobanco. Por supuesto, deberemos realizar estudios genéticos previos para buscar tumores que tengan, o no, la mutación que estamos estudiando. Para simplificar, imaginemos un caso ideal en el que hemos conseguido dos muestras de melanoma con alteraciones en la proteína X y dos que no. Por lo general, el material tumoral de partida es escaso, insuficiente para implantar el número de ratones necesarios para el experimento, ¿qué hacemos?
Tengamos en cuenta el diseño del experimento:
Si usamos un número de siete animales por grupo necesitaremos, de cada uno de los tumores, material para implantar 28 ratones. Como probablemente no tengamos suficiente tejido tumoral como para implantar a todos los animales, necesitaremos expandir este material.
En este caso, como trabajamos con melanomas, los implantaremos bajo la piel mediante una pequeña cirugía. Dejaremos que crezcan, midiéndolos regularmente cada pocos días, hasta que alcancen un cierto volumen (por ejemplo, 200 mm3).
Es el momento de repartir los animales en los grupos experimentales (ver ilustración de arriba). Como no todos los animales tendrán tumores de un mismo tamaño, repartiremos entre los grupos aquellos con tumores más grandes y pequeños, para lograr una mayor homogeneidad. Ahora, por fin, podemos iniciar el estudio y tratar los animales con el compuesto B o con un tratamiento control (lo óptimo es utilizar el líquido vehículo en el que se ha disuelto el compuesto B, pero sin añadir el compuesto):
A partir de este momento, para comprobar el efecto de los tratamientos, deberemos seguir de cerca el crecimiento de los tumores mediante mediciones periódicas. En función del tumor, pueden hacerse dos veces por semana, o incluso diariamente en tumores que crecen con rapidez. Las mediciones se efectúan con un calibre (una especie de llave inglesa graduada) y paciencia, porque hay que monitorizar cada uno de los tumores de forma individual. Hay que tener en cuenta que las mediciones de un experimento las debe hacer siempre la misma persona, porque cada investigador presenta sutiles diferencias en su forma de medir. De no hacerlo, el impacto en el experimento puede ser considerable. Además, es importantísimo permanecer alerta ante cualquier signo de malestar en los ratones, como pelo erizado, inactividad, encorvamiento o pérdida de peso, que pueden ser signos de que el tratamiento que les estamos administrando les está resultando tóxico, ante lo cual es aconsejable finalizar el mismo.
Cuando los tumores alcanzan un tamaño máximo (suele estar en torno a los 1.500 mm3) se debe terminar el experimento por razones humanitarias. Se sacrifica a los animales de una forma extremadamente regulada y, si lo necesitamos, podemos extraer los tumores para futuros experimentos de microscopía, citometría, secuenciación, etc. Es el momento de ver cómo ha funcionado el compuesto B. Haremos la media de los tamaños de los tumores de los animales de cada grupo y lo representaremos en forma de curvas:
Como vemos, los dos tumores con mutaciones en la proteína X crecen mucho más lentamente que los que no la tienen, incluso parecen desaparecer con el tiempo. Estos resultados apoyan la hipótesis de que las pacientes que tienen mutaciones en ese gen podrían beneficiarse del compuesto B en una hipotética futura terapia. Pero seamos cautos, lo que observamos en modelos de ratón y en xenografts no siempre tiene una traducción directa a los ensayos clínicos. De hecho, a veces estos animales muestran resistencia a fármacos que luego resultan ser tóxicos en humanos, y viceversa. Aun así, unos resultados así constituyen unos buenos cimientos sobre los que seguir investigando.
7.6. Conclusión
Este capítulo ha sido tan diferente que esperamos no haber abrumado y aburrido al lector hasta la extenuación. No ha sido fácil resumir y explicar de manera condensada el funcionamiento de las técnicas de laboratorio. Tampoco ha sido sencillo seleccionar aquellas metodologías que entraban en el capítulo y cuáles se quedaban fuera. Es posible que el lector esperase que se profundizase más en algunas cosas o que eche de menos algún método que no hemos comentado. Aun así, la idea de este capítulo era sumergirse durante unas páginas en los laboratorios de investigación y ser testigo de primera mano de cómo se organizan, planifican y ejecutan los experimentos.
Esperamos que hayáis disfrutado, porque en el próximo capítulo, ¡volveremos de nuevo a la inmunoterapia y las células del sistema inmunitario!
Cuadros:
Cuadro 1: Para el lector no científico
En el laboratorio entendemos por artefacto todo resultado obtenido en un experimento que no refleja la realidad, sino que está causado por un motivo técnico. Si no los identificamos, podemos dar por buenos resultados que no son ciertos.
Cuadro 2: Para el lector avanzado
Algunas tinciones típicas de células humanas para citometría
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Leucocitos (genérico) |
CD45. Muy útil para seleccionar de entrada solo los leucocitos y descartar otros tipos de célula. Combinable con cualquiera de las siguientes tinciones |
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Linfocitos T (genérico) |
CD3 |
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Linfocitos T cooperadores (genérico) |
CD3, CD4 |
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Linfocitos T cooperadores (genérico) |
CD3, CD4 |
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Linfocitos citotóxicos (genérico) |
CD3, CD8 |
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Marcadores genéricos de activación de linfocitos T |
CD69, CD25 |
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Linfocitos T cooperadores Th1 |
CD3, CD4, interferón gamma |
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Linfocitos T cooperadores Th2 |
CD3, CD4, interleucina 4 |
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Linfocitos T citotóxicos activados |
CD3, CD8, interferón gamma |
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Linfocitos T reguladores |
CD3, CD4, CD25, FoxP3 |
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Linfocitos T citotóxicos exhaustos |
CD3, CD8, PD1 |
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Linfocitos B (genérico) |
CD19, CD20, NO CD3 |
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Células NK: NO CD3, CD16 y CD56 |
NO CD3, CD16 y CD56 (ya que algunos linfocitos T pueden tener CD56) |
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Células dendríticas (genérico) |
HLA-DR, NO CD3, CD19 o CD20. Luego hay otros marcajes para diferentes linajes |
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Macrófagos |
CD11b, CD68, CD14 |
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Neutrófilo |
CD11b, CD15, CD16 |
Cuadro 3: La citometría que se nos viene encima
Desde el nacimiento de la citometría se han incorporado más y mejores láseres, refinado los sistemas de flujo y reducido el tamaño de los aparatos. Además, las herramientas de análisis informático son cada vez más sencillas de utilizar por un usuario no especializado. Y, sin embargo, el mecanismo básico sigue siendo fundamentalmente el mismo. Se está avanzando, eso sí, en aparatos que combinan la citometría con otras técnicas. Un ejemplo de esto son los instrumentos que combinan un citómetro con un microscopio, de manera que además de los datos puramente numéricos obtenemos una imagen de cada una de las células.
Por último, hace poco se han empezado a utilizar otro tipo de citómetros, que, en lugar de recoger y analizar la luz de determinadas longitudes de onda, son capaces de recibir y estudiar a la vez todos los tipos de luz que emite cada uno de los fluoróforos de manera individual e incluso la célula sin teñir. Como miden el espectro de luz completo de cada célula, se denominan citómetros espectrales, y son capaces de generar algo parecido a una huella dactilar de citometría de cada tipo de célula. Estas máquinas tienen un potencial increíble para detectar y describir poblaciones tumorales (conocidas o desconocidas) de una muestra, incluso si se encuentran en porcentajes minúsculos. De todas maneras, su uso requiere una gran comprensión de la citometría y un alto grado de especialización con este instrumento, y hoy por hoy todavía no se utilizan de manera sistemática.
Cuadro 4: Para el lector no científico
El ADN se compone de cuatro tipos de moléculas, llamadas nucleótidos, aunque como son exactamente iguales excepto en un elemento denominado “base nitrogenada”, cuando hablemos de la secuencia del ADN hablaremos de bases. Cada cadena de ADN es una serie de bases en una secuencia determinada. Cada una de las bases de una de las hebras se une a otra base de la otra hebra. Las A (adeninas) se unen a T (timina). Las G (guanina) se unen a C (citosina).
Agradecimientos: Gracias a María González Cao por su constante ayuda, guía y sugerencias. A Jesús Sánchez Botí y Miriam Agúndez por su exhaustiva revisión. A Carlos del Fresno por aclararme dudas clave. A Ana Virto por seguir empujando este proyecto.
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