7.2.3. Microscopía de fluorescencia y confocal

Las medusas son seres sencillos, pero dan mucha guerra. Poca gente apostaría por que una medusa pudiera desatar una revolución en la biotecnología, pusiese patas arriba la investigación e incluso fuera la base de una serie de trabajos que se coronaron con un Nobel en 2008. Estamos hablando de la Aequoria victoria, una curiosa medusa que cuando se siente amenazada emite una suave luz verde.
En 1962 se descubrió que esta luz se producía gracias a un fluoróforo que llamaron Green Fluorescent Protein (GRP).

El GFP inauguró la era de las proteínas fluorescentes. Se desarrollaron métodos para mejorarlo y estabilizarlo, también para conseguir variaciones en el color que emitía (Yellow, Cyan, Blue Fluorescente Proteins, o YFP, CFP y BFP). Se encontraron otras proteínas fluorescentes en corales como el discosoma y se consiguieron derivados como la Red Fluorescent Protein (RFP) y muchas más. Hoy en día hay proteínas fluorescentes que cubren el espectro de colores visible, incluso hay algunas que emiten en colores que no vemos, pero podemos detectar.

Ahora bien, no siempre podemos introducir una proteína fluorescente en un organismo mediante la manipulación genética. En el caso de nuestro proyecto ficticio, queremos analizar muestras tumorales, extraídas de pacientes humanos tratados con inmunoterapia. En ellas queremos analizar si hay más linfocitos T que estén liberando interferón en la zona del tumor, es decir, que están más activos. Como las células humanas no emiten fluorescencia espontáneamente, la solución es, cómo no, utilizar anticuerpos.
De la misma manera que trabajábamos con muestras de inmunohistoquímica, podemos detectar la proteína que nos interesa con un anticuerpo contra interferón unido a una proteína fluorescente. No siempre encontraremos un anticuerpo comercial unido a una proteína fluorescente, por lo que podemos emplear, como antes, un anticuerpo contra interferón y luego un secundario unido, por ejemplo, a RFP. El uso de anticuerpos unidos a moléculas fluorescentes se denomina inmunofluorescencia.
Por lo general, para estar seguros de que lo que vemos bajo el microscopio refleja la realidad, se suelen teñir varios elementos celulares simultáneamente en cada análisis bajo el microscopio. Por ejemplo, para contextualizar nuestro interferón en la célula, podemos teñir los núcleos de las células con un tinte fluorescente que emita luz azul. También podemos teñir con anticuerpos el citoesqueleto de la célula, para ver por dónde andan las vesículas que contienen el interferón.
Escoger correctamente los fluoróforos es un auténtico arte, ya que las proteínas fluorescentes no emiten solo en una longitud de onda. Es decir, las proteínas como el GFP también emiten un poco en rojo, (y viceversa, muchas proteínas que emiten principalmente en rojo pueden tener emisión residual en verde). Por lo tanto, si no andamos con cuidado, podemos confundir lo que estamos viendo e interpretar incorrectamente los resultados.

Para analizar nuestra muestra marcada con proteínas fluorescentes necesitamos un microscopio de fluorescencia. Tiene varias particularidades que lo hacen diferente de un microscopio normal:

Gracias a la inmunofluorescencia podemos estudiar cuestiones como la presencia, localización, distribución y, de forma aproximada, la cantidad de la proteína que nos interesa, en este caso el interferón de los linfocitos T.

Pero podemos ser más finos aún. La microscopía de fluorescencia tiene una limitación que debemos tener en cuenta:

Mediante técnicas ópticas podemos excitar un solo punto de la muestra, y recoger exclusivamente la luz emitida por ese punto. Tal como vemos en el dibujo siguiente, podemos recoger todos los puntos que hay en un plano, y obtener una imagen de una sección de la imagen; como si cortáramos una loncha, vamos. Generalmente, por motivos de potencia, en lugar de lámparas normales se utilizan láseres, y en lugar de observar por un objetivo, lo visualizamos a través de un ordenador. Este método se denomina microscopía confocal y es esencial para comprender cómo están localizados los elementos celulares en el espacio. Estas técnicas permiten observar, por ejemplo, en qué punto exacto se une un linfocito T a una célula tumoral para destruirla.

Existe una aplicación muy útil de la microscopía confocal, en especial para comprender cómo se distribuyen e interaccionan entre sí las diferentes células en un tejido. Si analizamos diferentes secciones de un mismo tejido, podemos apilar digitalmente una encima de la otra y hacer una reconstrucción 3D del tejido. Si en nuestras muestras de tumores humanos queremos saber dónde se encuentran las células tumorales con respecto a los vasos sanguíneos y dónde se encuentran los linfocitos T, podemos hacer una reconstrucción 3D del tejido y obtener datos mucho más informativos de la posición de cada una de las células.

Cuando se explican las técnicas, suelen parecer fabulosas y casi mágicas. Sin embargo, seamos cautos. En especial, en el mundo de la microscopía de fluorescencia y confocal hay que ir con muchísimo cuidado a la hora de analizar cada muestra. La mayoría de fluoróforos emiten en más de un color, pueden interferir en lo que vemos y, si no damos con los ajustes adecuados en el microscopio, podemos llegar a conclusiones completamente erróneas: El procesamiento de la muestra, los productos que utilizamos o los anticuerpos que usemos para marcar pueden causarnos una gran variedad de artefactos (cuadro 1).